我分析的是空间转录组数据，所以下面以10x Fresh Frozen空间转录组数据为例。

集群搭建与环境配置

实验室暂时没有服务器，租了阿里云服务器。实例规格ecs.r6.4xlarge，16核CPU，128G内存，这个规格后续被证明是刚好够用且好用的。

公司给出的数据就是从阿里云的OSS服务下载，从他们自己的OSS搞到ECS上自然非常方便。具体过程略去。

开搞之前，要先在服务器上安装环境，我只装了一个Ubuntu 22.04 64位系统，别的啥也没有，干脆从头开始。于是需要从网站上开始找需要配置的环境。

官方文档提供了很多信息: Space Ranger User Guide，可以参考。

使用curl安装Space Ranger：

curl -o spaceranger-2.1.0.tar.gz "https://cf.10xgenomics.com/releases/spatial-exp/spaceranger-2.1.0.tar.gz?..."

同时需要下载参考数据库，也就是基因组注释之类的，我这里下载了老鼠的数据库

curl -O "https://cf.10xgenomics.com/supp/spatial-exp/refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz"

新建一个文件夹来装这些东西，把下载的压缩包挪进去之后解压,并将spaceranger添加到环境变量（路径位置根据自己的来）：

tar -xzvf spaceranger-2.0.1.tar.gz
tar -xzvf refdata-gex-mm10-2020-A.tar.gz
export PATH=~/ST/spaceranger-2.0.1:$PATH

测试运行：

spaceranger testrun --id=tiny

接下来就会出现一大长串测试结果，如果有问题就会报错，根据问题解决就行了。

安装完成，接下来要选择合适的pipeline进行基础分析。关于选择pipeline，官网有一些说明：Choosing-a-pipeline。简单地说，就是如果是单独的片子，可以用spaceranger count，多个相同处理，可以用spaceranger aggr。所以我们这次先用count这个。

数据输入格式

spaceranger count的输入主要是FASTQ，如果公司提供的不是fastq而是BCL什么的，那你还需要使用spaceranger mkfastq这种东西再跑一遍。

运行spaceranger count

好，重头戏要来了（狂喜）。

运行参数具体介绍可以参考：Space Ranger Command Line Arguments。我这里只写一些必要的东西。如以下示例：

spaceranger count --id=APP-2m \
--fastqs=~/ST/fastqpath \
--transcriptome=~/ST/refdata-gex-mm10-2020-A \
--image=~/ST/APP-2m.tif \
--slide=V19J01-123 \
--area=B1
--create-bam=false

接下来分别介绍这些参数的功能：

  • --id: 指这次运行的代号，你自己指定一个就行，最好不要与过去和未来的重复。
  • --fastqs: 指输入的FASTQ文件所在的目录，注意不是文件名。
  • --transcriptome: 指参考转录组的位置，就是刚刚下载的那个老鼠的基因组参考数据库，这个是到文件夹的路径，注意最好是绝对路径，之前踩过坑跑不出来。
  • --image: 这个参数写图片的位置。因为是空转，测序之前肯定会做一个HE染色的图或者免疫染色的图后续映射用，是一张很大的脑片图，一般是一个tiff文件。注意也是到文件本身
  • --slide: 装片编号。所有可以用于空转测序的载玻片，都必须使用10x官方售卖的耗材，更鸡贼的是他们每个装片都是由单独编号的，这里就写你那个装片耗材上的编号。公司会告诉你编号，如果没告诉你那就肯定是在文件名字上体现的，这个装片编号格式一般为V**?**-***，其中?为字母，*为数字。
  • --area: 装片区域。跟上一条是相对应的，每个官方指定耗材上都有四个区域可以放脑片，所以空转送样一般会让你送四的倍数个。四个区域分别是A1，B1，C1，D1。
  • --create-bam: 是否创建bam文件，这个参数是必须的，挺奇怪吧。

其它参数的介绍可以参看上面的网址。输入这些参数后，正常就可以开始跑了，跑的其实还挺快的，跑一个数据按照我的配置30-40分钟就能跑完。跑完得到的结果就可以直接下载下来或者留在服务器上继续分析了。